Chapitre 1. Introduction à la technique de cytométrie en flux | ||
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La cytométrie en flux ou FACS (fluorescence-assisted cell sorting) est une technique d’analyse de phénotype cellulaire assistée par ordinateur.
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Chaque cellule présente dans un échantillon donné (cellules isolées et mises en suspension) est analysée individuellement : la puissance de cette technique réside donc dans la possibilité d’analyser un grand nombre de cellules en un temps relativement court, conférant à la technique une robustesse statistique intéressante.
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a - L’échantillon contenant la suspension cellulaire à analyser est fixé hermétiquement à une tige creuse sur l’appareil. De l’air est injecté dans le tube, forçant l’échantillon à remonter dans la tige. La colonne d’échantillon est alors gainée par une colonne de liquide tampon. L’échantillon passe ainsi dans la chambre de lecture où il est excité par un faisceau laser. Le gainage par le tampon (b - schéma en coupe transversale de la colonne d’échantillon) permet de forcer les cellules (en gris) à passer une par une dans la chambre de lecture (à gauche, diamètre de la colonne d’échantillon trop important, à droite, diamètre correct)
La cytométrie en flux permet d’analyser deux types de paramètres :
La diffusion frontale du faisceau incident (forward scatter, FSC) indique la taille des cellules, la diffusion latérale (side scatter, SSC) indique la granularité.
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Dans cet exemple, on cherche à identifier les lymphocytes T parmi une
population de lymphocytes B et T. Les LT expriment le marqueur de surface CD3, et les LB
ne l’expriment pas. On utilise donc des anticorps anti-CD3 couplés à un fluorochrome
pour marquer en fluorescence la population de LT de façon spécifique.
En combinant différents anticorps couplés à des fluorochromes distincts, on
peut analyser simultanément un grand nombre de paramètres (expression de différents
marqueurs de surface par exemple). Le nombre de paramètres analysables dépend du
cytomètre utilisé, les plus performants analysant jusqu’à 19 paramètres simultanément.
Ce diagramme indique les deux lasers et les différents détecteurs (FSC, SSC, FL1 à 4) présents dans le cytomètre et autorisant une analyse multiparamétrique. Les filtres optiques utilisés sont également figurés. Les fluorochromes détectables sont indiqués à côté de chaque détecteur de fluorescence.
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