Chapitre 1. Introduction à la technique de cytométrie en flux
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Chapitre 1. Introduction à la technique de cytométrie en flux

La cytométrie en flux ou FACS (fluorescence-assisted cell sorting) est une technique d’analyse de phénotype cellulaire assistée par ordinateur.

Figure 1.3. un cytomètre de flux : exemple de l'appareil FACSCalibur

Chaque cellule présente dans un échantillon donné (cellules isolées et mises en suspension) est analysée individuellement : la puissance de cette technique réside donc dans la possibilité d’analyser un grand nombre de cellules en un temps relativement court, conférant à la technique une robustesse statistique intéressante.

Figure 1.5. La circulation des fluides dans l'appareil et le trajet de la lumière.
a - L’échantillon contenant la suspension cellulaire à analyser est fixé hermétiquement à une tige creuse sur l’appareil. De l’air est injecté dans le tube, forçant l’échantillon à remonter dans la tige. La colonne d’échantillon est alors gainée par une colonne de liquide tampon. L’échantillon passe ainsi dans la chambre de lecture où il est excité par un faisceau laser. Le gainage par le tampon (b - schéma en coupe transversale de la colonne d’échantillon) permet de forcer les cellules (en gris) à passer une par une dans la chambre de lecture (à gauche, diamètre de la colonne d’échantillon trop important, à droite, diamètre correct)

La cytométrie en flux permet d’analyser deux types de paramètres :

les paramètres morphologiques, taille et granularité ;
les paramètres de fluorescence, liés à l’utilisation de marqueurs fluorescents. Cette technique est en particulier utilisée pour analyser par immunodétection l’expression de marqueurs de surface caractéristiques de populations leucocytaires.

Figure 1.6. Analyse des paramètres morphologiques : taille et granularité.
La diffusion frontale du faisceau incident (forward scatter, FSC) indique la taille des cellules, la diffusion latérale (side scatter, SSC) indique la granularité.

Figure 1.7. L'utilisation de fluorochromes

Figure 1.8. Analyse des paramètres de fluorescence : expression de marqueurs de surface.

Dans cet exemple, on cherche à identifier les lymphocytes T parmi une population de lymphocytes B et T. Les LT expriment le marqueur de surface CD3, et les LB ne l’expriment pas. On utilise donc des anticorps anti-CD3 couplés à un fluorochrome pour marquer en fluorescence la population de LT de façon spécifique.

En combinant différents anticorps couplés à des fluorochromes distincts, on peut analyser simultanément un grand nombre de paramètres (expression de différents marqueurs de surface par exemple). Le nombre de paramètres analysables dépend du cytomètre utilisé, les plus performants analysant jusqu’à 19 paramètres simultanément.

Figure 1.10. Système optique du FACSCalibur.
Ce diagramme indique les deux lasers et les différents détecteurs (FSC, SSC, FL1 à 4) présents dans le cytomètre et autorisant une analyse multiparamétrique. Les filtres optiques utilisés sont également figurés. Les fluorochromes détectables sont indiqués à côté de chaque détecteur de fluorescence.

Figure 1.11. Utilisation du cytomètre pour distinguer les cellules suivant leur teneur en ADN

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