Chapitre 2. Présentation du logiciel Cytométrie et de ses applications en immunologie
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Chapitre 2. Présentation du logiciel Cytométrie et de ses applications en immunologie

Table des matières

Logiciel libre et gratuit : adresse de téléchargement et notice complète : http://acces.ens-lyon.fr/acces/logiciels/cytometrie/le-logiciel-cytometrie

Le logiciel Cytométrie permet de traiter des données de cytométrie en flux. [1] Orienté vers une utilisation pédagogique simplifiée, ce logiciel n'a pas la prétention de remplacer les logiciels professionnels. Il a été développé par Jean-François Madre dans le cadre de l'IFÉ (Institut Français de l'Éducation – ENS-Lyon) avec l'aide de Chloé Journo et Katia Mayol.

Dans l'enseignement secondaire, son utilisation principale concerne l'immunologie. Il permet de se familiariser avec les marqueurs de surface utilisables en complément de la microscopie pour distinguer les différentes populations de cellules immunitaires.

Trois exemples vont être présentés :

Identification et numération des leucocytes du sang

Cette œuvre est mise à disposition selon les termes de la Licence Creative Commons Attribution - Pas d'Utilisation Commerciale - Pas de Modification 4.0 International.

Figure 2.1. Distinction de trois catégories

Identification d'après la taille et la granularité

D'après l'observation microscopique d'un frottis sanguin :

  • les lymphocytes sont de petite taille, voisine de celle des hématies, et peu granuleux ;
  • les granulocytes sont de grande taille et ont un cytoplasme granuleux ;
  • les monocytes sont assez gros et assez peu granuleux.

Lancer le logiciel Cytométrie et ouvrir le fichier sang.fcs.

Figure 2.2. Taille et granularité des Leucocytes sanguins.


Le logiciel affiche le graphique en nuage de points (« dot plot ») de la granularité des cellules (mesure SSC – side scatter du cytomètre) en fonction de leur taille (mesure FSC – forward scatter). Chaque point correspond à une cellule [2] . Les échelles sont en unités arbitraires. On repère ainsi les trois populations de leucocytes.

Cette œuvre est mise à disposition selon les termes de la Licence Creative Commons Attribution - Pas d'Utilisation Commerciale - Pas de Modification 4.0 International.

Figure 2.3. Délimitation des trois catégories


Figure 2.4. Repérage de différents types de leucocytes.


Pour délimiter ces catégories sur le graphique, il faut utiliser le menu Catégories / Délimiter ... (menu de la fenêtre du graphique).

- Il faut alors faire un clic gauche sur chaque angle du polygone entourant le nuage de points à délimiter. Pour terminer (et fermer le polygone), cliquer sur le bouton droit de la souris.

- La fenêtre des catégories qui s'ouvre demande le nom de la catégorie délimitée. Taper le nom puis cliquer sur OK pour valider.

- Recommencer l'opération pour chaque catégorie.

Pour dénombrer les différentes populations leucocytaires ainsi définies, utiliser le menu Statistiques. En faisant défiler les données dans la fenêtre statistiques, on peut vérifier que les proportions de lymphocytes, granulocytes et monocytes sont à peu près les mêmes dans les trois jeux de données.

Identification des lymphocytes B et T par les marqueurs de surface CD19 et CD2

Les lymphocytes B expriment spécifiquement le marqueur CD19 et les lymphocytes T le marqueur CD2. Ce sont les marqueurs détectés dans le premier jeu de données.

Cette œuvre est mise à disposition selon les termes de la Licence Creative Commons Attribution - Pas d'Utilisation Commerciale - Pas de Modification 4.0 International.

Figure 2.5. Distinction des catégories de Lymphocytes


Cliquer sur Affichage / Choix des paramètres et choisir CD19 comme paramètre 1 et CD2 comme paramètre 2. Le graphique s'affiche :

Figure 2.6. Repérage des lymphocytes B et des lymphocytes T.


Les populations de lymphocytes B et T ont été délimitées avec l'outil de délimitation des catégories.

Si on clique à nouveau sur le menu Statistiques, les nouvelles catégories seront incluses dans les statistiques.

Identification des sous-populations de lymphocytes T par les marqueurs de surface CD4 et CD8

Les lymphocytes exprimant le marqueur CD4 sont pour la plupart des lymphocytes T auxiliaires LTa (ou LTh), tandis que ceux exprimant le marqueur CD8 sont pour la plupart des lymphocytes T cytotoxiques LTc, responsables de la lyse spécifique de cellules infectées ou altérées.

Cliquer sur Affichage / Choix des paramètres, puis choisir Données : CD4-CD8 .

Le graphique en nuage de points de la granularité en fonction de la taille s'affiche. Les trois catégories définies sur le premier graphique (lymphocytes, monocytes, granulocytes) y sont délimitées.

Choisir CD8 comme paramètre 1 et CD4 comme paramètre 2. On repère facilement les deux populations de lymphocytes CD4+ et CD8+ sur ce graphique.

Figure 2.7. Distinction entre lymphocytes Ta et lymphocytes Tc.


On a délimité les populations de lymphocytes T CD4+ (les LTa) et T CD8+ (les LTc). On remarque également que les monocytes expriment faiblement le marqueur CD4. Ceci explique que les monocytes sont, comme les LT CD4+, des cellules cibles du virus du SIDA.

Vérification de la délimitation de la population de monocytes

Les monocytes portent un marqueur spécifique, le CD14. Le troisième jeu de données permet de vérifier que les monocytes ont été bien délimités sur le graphique taille / granularité.

Cliquer sur Affichage / Choix des paramètres puis choisir Données : CD14-CD45.

Choisir CD45 comme paramètre 1 et CD14 comme paramètre 2. On repère facilement les monocytes, qui expriment nettement le marqueur CD14.

Figure 2.8. Repérage des Monocytes.


Les points de couleur verte correspondent à la délimitation des monocytes par leur taille et leur granularité qui a été réalisée sur le premier graphique. On remarque que cette délimitation était correcte.

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Figure 2.9. Amélioration de l'affichage




[1] Le logiciel lit les données de cytométrie aux formats FCS2.0 et FCS3.0

[2] Chaque point correspond à un « événement » détecté, dans la plupart des cas, il s'agit d'une cellule.