Chapitre 2. Présentation du logiciel Cytométrie et de ses applications en immunologie | ||
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Logiciel libre et gratuit : adresse de téléchargement et notice complète : http://acces.ens-lyon.fr/acces/logiciels/cytometrie/le-logiciel-cytometrie
Le logiciel Cytométrie permet de traiter des données de cytométrie en flux. [1] Orienté vers une utilisation pédagogique simplifiée, ce logiciel n'a pas la prétention de remplacer les logiciels professionnels. Il a été développé par Jean-François Madre dans le cadre de l'IFÉ (Institut Français de l'Éducation – ENS-Lyon) avec l'aide de Chloé Journo et Katia Mayol.
Dans l'enseignement secondaire, son utilisation principale concerne l'immunologie. Il permet de se familiariser avec les marqueurs de surface utilisables en complément de la microscopie pour distinguer les différentes populations de cellules immunitaires.
Trois exemples vont être présentés :
D'après l'observation microscopique d'un frottis sanguin :
Lancer le logiciel Cytométrie et ouvrir le fichier sang.fcs.
Le logiciel affiche le graphique en nuage de points (« dot plot ») de
la granularité des cellules (mesure SSC – side scatter du cytomètre) en fonction
de leur taille (mesure FSC – forward scatter). Chaque point correspond à une cellule
[2]
. Les échelles sont en unités arbitraires. On repère ainsi les trois
populations de leucocytes.
Pour délimiter ces catégories sur le graphique, il faut utiliser le
menu Catégories / Délimiter ... (menu de la
fenêtre du graphique).
- Il faut alors faire un clic gauche sur chaque angle du polygone entourant le nuage de points à délimiter. Pour terminer (et fermer le polygone), cliquer sur le bouton droit de la souris.
- La fenêtre des catégories qui s'ouvre demande le nom de la catégorie délimitée. Taper le nom puis cliquer sur OK pour valider.
- Recommencer l'opération pour chaque catégorie.
Pour dénombrer les différentes populations leucocytaires ainsi définies, utiliser le menu Statistiques. En faisant défiler les données dans la fenêtre statistiques, on peut vérifier que les proportions de lymphocytes, granulocytes et monocytes sont à peu près les mêmes dans les trois jeux de données.
Les lymphocytes B expriment spécifiquement le marqueur CD19 et les lymphocytes T le marqueur CD2. Ce sont les marqueurs détectés dans le premier jeu de données.
Cliquer sur Affichage / Choix des paramètres et choisir CD19 comme paramètre 1 et CD2 comme paramètre 2. Le graphique s'affiche :
Les populations de lymphocytes B et T ont été délimitées avec l'outil
de délimitation des catégories.
Si on clique à nouveau sur le menu Statistiques, les nouvelles catégories seront incluses dans les statistiques.
Les lymphocytes exprimant le marqueur CD4 sont pour la plupart des lymphocytes T auxiliaires LTa (ou LTh), tandis que ceux exprimant le marqueur CD8 sont pour la plupart des lymphocytes T cytotoxiques LTc, responsables de la lyse spécifique de cellules infectées ou altérées.
Cliquer sur Affichage / Choix des paramètres, puis choisir Données : CD4-CD8 .
Le graphique en nuage de points de la granularité en fonction de la taille s'affiche. Les trois catégories définies sur le premier graphique (lymphocytes, monocytes, granulocytes) y sont délimitées.
Choisir CD8 comme paramètre 1 et CD4 comme paramètre 2. On repère facilement les deux populations de lymphocytes CD4+ et CD8+ sur ce graphique.
On a délimité les populations de lymphocytes
T CD4+ (les LTa) et T CD8+ (les LTc). On remarque
également que les monocytes expriment faiblement le marqueur CD4. Ceci explique
que les monocytes sont, comme les LT CD4+, des cellules cibles du virus du SIDA.
Les monocytes portent un marqueur spécifique, le CD14. Le troisième jeu de données permet de vérifier que les monocytes ont été bien délimités sur le graphique taille / granularité.
Cliquer sur Affichage / Choix des paramètres puis choisir Données : CD14-CD45.
Choisir CD45 comme paramètre 1 et CD14 comme paramètre 2. On repère facilement les monocytes, qui expriment nettement le marqueur CD14.
Les points de couleur verte correspondent à la délimitation des
monocytes par leur taille et leur granularité qui a été réalisée sur le premier
graphique. On remarque que cette délimitation était correcte.
[1] Le logiciel lit les données de cytométrie aux formats FCS2.0 et FCS3.0
[2] Chaque point correspond à un « événement » détecté, dans la plupart des cas, il s'agit d'une cellule.